細胞凋亡檢測試劑盒的原理、使用方法及注意事項

細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡是為維持環(huán)境穩定，為更好的適應勝春環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，是一種字體損傷的現象。zui常用的目前就是細胞凋亡檢測試劑盒。

細胞凋亡檢測試劑盒原理

細胞凋亡是細胞的基本特征之一，在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內環(huán)境的穩定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8 KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過(guò)程中翻轉到膜外的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結合。FITC-Annexin V結合到凋亡細胞后，在藍色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區分出凋亡細胞與正常細胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整細胞膜，但對凋亡晚期細胞和死細胞的破損細胞膜能夠穿透，并使細胞核紅染。將FITC-Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞區分開(kāi)來(lái)。

細胞凋亡檢測試劑盒使用步驟

1. 調整待測細胞的濃度為5×105-1×106個(gè)/ml。 2. 取1ml細胞，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清。 3. 加入1ml預冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清（對于貼壁細胞，先用胰酶消化，再用PBS洗滌）。 4. 重復步驟3兩次。 5. 將細胞重懸于200μl Binding Buffer。 6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘 或4℃反應30 分鐘。 7. 加入300μl Binding Buffer，在1小時(shí)內用流式細胞儀檢測。 8. 若用熒光顯微鏡檢測，將細胞混合液離心，取細胞沉淀涂片，再進(jìn)行觀(guān)察。

使用細胞凋亡檢測試劑盒的注意事項

為保證得到理想的實(shí)驗結果在使用此試劑盒之前請認真閱讀該注意事項。

1.旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

2.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質(zhì)，在保存與操作時(shí)請注意避光。

3.Propidium iodide（PI）能通過(guò)皮膚吸收，對眼睛有刺激作用。

4.在細胞洗滌的zui后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留影響實(shí)驗結果。

 5.PI染色時(shí)間過(guò)長(cháng)有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC染色，上機前5分鐘再加入PI染色。

6.整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作。

7.反應完畢后請盡快檢測，因為細胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，反應1小時(shí)后熒光強度就開(kāi)始衰變。

8.成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類(lèi)型、細胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時(shí)PS翻轉的比例、誘導細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導凋亡的時(shí)間等，把這些影響因素進(jìn)行優(yōu)化對實(shí)驗成功是非常必要的。